CCK8試劑盒基于WST-8法檢測細胞活性和增殖情況。其核心成分是水溶性的四唑鹽化合物WST-8，它在電子耦合試劑的幫助下，可被活細胞線粒體中的脫氫酶還原，生成高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物。這種顏色變化的深淺與活細胞的數(shù)量直接相關——細胞越多、代謝越旺盛，產(chǎn)生的甲臜越多，溶液顏色也就越深。通過酶標儀在特定波長下測定吸光度，通常選擇450nm處的OD值作為量化指標。由于甲臜產(chǎn)物的水溶性特點，無需像傳統(tǒng)MTT法那樣使用有機溶劑溶解沉淀，簡化了操作流程并減少實驗誤差。
 

　　CCK8試劑盒的測定步驟：
 

　　1.實驗設計與鋪板
 

　　-細胞準備：選取對數(shù)生長期的目的細胞(如貼壁細胞需先消化重懸)，調(diào)整密度至適宜范圍(通常為5×10~1×10個/孔，具體因細胞類型而異)。避免過高或過低密度導致信號過飽和或靈敏度不足。
 

　　-分組設置：根據(jù)需求設置空白組(僅培養(yǎng)基+試劑)、對照組(未處理的正常細胞)、實驗組(不同濃度藥物/刺激因素處理)。每組設3個以上復孔以保證統(tǒng)計有效性。
 

　　-接種培養(yǎng)：將細胞懸液加入96孔板(常用透明平底板)，每孔體積一般為100~200μL，置于CO培養(yǎng)箱預培養(yǎng)適當時間(如24h)，待細胞貼壁后進行后續(xù)處理。
 

　　2.加樣與孵育
 

　　-處理干預：按實驗方案向各孔添加待測物質(如藥物、毒素等)，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間(例如24h、48h)。注意控制處理條件一致性(溫度、濕度、CO濃度)。
 

　　-添加CCK8溶液：取出培養(yǎng)板，每孔加入10μLCCK8試劑(推薦比例為培養(yǎng)基體積的1/10，即若每孔原有100μL培養(yǎng)基，則加10μL試劑)。輕輕震蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
 

　　關鍵細節(jié)：無需更換原培養(yǎng)基，直接疊加即可；若藥物顏色干擾嚴重(如深色)，可短暫離心后小心吸取上清再補加新鮮培養(yǎng)基+CCK8。
 

　　3.顯色反應與讀數(shù)
 

　　-避光孵育：將加完試劑的96孔板放回培養(yǎng)箱，避光孵育1~4小時(時間需預實驗摸索，通常2小時足夠)。隨著時間延長，吸光度值會逐漸升高，但超過線性范圍可能導致誤差。
 

　　-酶標儀檢測：使用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長下測定各孔吸光度(OD值)。若設備支持雙波長模式，可同時讀取600nm作為參比波長以校正背景干擾。
 

　　-數(shù)據(jù)處理：計算各組平均OD值，以空白組調(diào)零后，比較不同組間的相對細胞活力(公式：(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100)。